Staphylococcus aureus impairs sinonasal epithelial repair: Effects in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps and control subjects. Fecha: Martes 12 de marzo
Staphylococcus aureus impairs sinonasal epithelial repair: Effects in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps and control subjects.
Authors:
Valera FCP1, Ruffin M2, Adam D2, Maillé É3, Ibrahim B4, Berube J5, Rousseau S5, Brochiero E2, Desrosiers MY6.
1 Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), Montreal, Quebec, Canada; Division of Otorhinolaryngology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo (FMRP-USP), Ribeirão Preto, Brazil.2 Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), Montreal, Quebec, Canada; Département de Médecine, Université de Montréal, Montreal, Quebec, Canada.
3 Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), Montreal, Quebec, Canada.
4 Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), Montreal, Quebec, Canada; Department of Otolaryngology, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM), Montreal, Quebec, Canada.
5 Meakins-Christie Laboratories, Research Institute of the McGill University Health Centre, Montreal, Quebec, Canada.
6 Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), Montreal, Quebec, Canada; Department of Otolaryngology, Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM), Montreal, Quebec, Canada. Electronic address: desrosiers_martin@hotmail.com.
Abstract:
BACKGROUND:
The effect of Staphylococcus aureus on nasal epithelial repair has never been assessed in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps (CRSwNP).
OBJECTIVE:
This study aimed to determine whether (1) nasal epithelial cell cultures from patients with CRSwNP and control subjects repair differently; (2) S aureus exoproducts compromise nasal epithelial repair; (3) S aureus alters lamellipodial dynamics; and (4) deleterious effects could be counteracted by the Rho-associated coiled-coil kinase inhibitor Y-27632.
METHODS:
Primary nasal epithelial cells (pNECs) collected during surgeries were cultured and injured under 3 conditions: (1) basal conditions, (2) exposed to S aureus exoproducts, and (3) exposed to S aureus exoproducts and Y-27632. Epithelial repair, lamellipodial dynamics, and cytoskeletal organization were assessed.
RESULTS:
Under basal conditions, pNEC cultures from patients with CRSwNP presented significantly lower repair rates and reduced lamellipodial protrusion length and velocity than those from control subjects. S aureus exoproducts significantly decreased repair rates and protrusion dynamics in both control subjects and patients with CRSwNP; however, the effect of S aureus on cell protrusions was more sustained over time in patients with CRSwNP. Under basal conditions, immunofluorescence assays showed significantly reduced percentages of cells with lamellipodia at the wound edge in patients with CRSwNP compared with control subjects. S aureus altered cell polarity and decreased the percentage of cells with lamellipodia in both groups. Finally, Y-27632 prevented the deleterious effects of S aureus exoproducts on CRSwNP repair rates, as well as on lamellipodial dynamics and formation.
CONCLUSIONS:
S aureus exoproducts significantly alter epithelial repair and lamellipodial dynamics on pNECs, and this impairment was more pronounced in patients with CRSwNP. Importantly, Y-27632 restored epithelial repair and lamellipodial dynamics in the presence of S aureus exoproducts.
DOI: 10.1016/j.jaci.2018.05.035
Staphylococcus aureus impairs sinonasal epitelial repair: Effects in patients with chronic rinosinusitis with nasal polyps and control subjects
ResponderEliminarLa rinosinusitis crónica (RSC) se define como la inflamación persistente de la mucosa sinunasal que dure al menos 12 semanas. La enfermedad afecta al 4.5 a 12% de la población de países Norte americanos y europeos y compromete la calidad de vida de los sujetos afectados. Los pacientes con RSC con poliposis nasal (RSCcPN) tienen peor calidad de vida que los pacientes con RSC sin poliposis nasal (RSCsPN), además 40% de los pacientes presentar recurrencia en los primeros 6 meses luego de cirugía endoscópica de senos para nasales y 20% requieren revisión quirúrgica en los siguientes 5 años. La fisiopatología de la RSCcPN aún no es clara. El S. aureus es una de las bacterias que se aísla con mayor frecuencia en los pacientes con RSC y es más común en los pacientes con RSCcPN. Se aísla en las capas profundas del epitelio y en localización intracelular e intercelular, esto parece afectar la evolución de la enfermedad, los pacientes con S. aureus intracelular tienen un mayor riesgo de recaídas clínicas y microbianas luego de la cirugía endoscópica sinusal, además el S. aureus podría tener otros efectos patogénicos que contribuyen con la disfunción de la barrera y que requieren ser identificados. Varios mecanismos biológicos se requieren para una reparación epitelial adecuada, incluyendo la migración, proliferación y re diferenciación celular. La familia Rho de pequeñas GTPasas es fundamental en estos procesos, incluyen la Rho, Rac y Cdc42 que regulan el citoesqueleto de actina, la migración celular y la proliferación de varios tipos de células epiteliales. Las kinasas embobinadas asociadas a la Rho (ROCKs) son kinasas serina/treonina reguladoras de los re arreglos del citoesqueleto, median la formación de fibras inductoras de stress RhoA y adhesión focal e inducen la contractilidad de la actomiosina, adhesión célula a célula, migración, diferenciación y proliferación celular. Esto implica que la vía ROCK tiene un rol en la reparación epitelial.
Este estudio tiene como objetivo comparar las características de reparación epitelial de las células epiteliales nasales primarias (pNEC) derivadas de sujetos control y sujetos con RSCcPN, investigar el compromiso del S. aureus en la reparación de los tejidos y evaluar como al Y-27632 (un inhibidor ROCK) podría prevenir los efectos negativos del S. aureus.
MÉTODOS:
Recolección de la muestra quirúrgica, aislamiento celular y cultivo primario:
Este estudio fue aprobado por la mesa de revisión institucional del centro hospitalario de la Universidad de Montreal, todos los participantes eran mayores de 18 años. Se realizo el diagnostico de RSCcPN según las guías de la academia americana de cirugía de cabeza y cuello y otorrinolaringología, y los pacientes que fallaban con el manejo medico se sometían a cirugía endoscopia sinusal. Los sujetos control se sometían a la cirugía por fugas de líquido cefalorraquídeo o por adenomas pituitarios no secretantes. Los criterios de exclusión incluían las inmunodeficiencias, disquinesia ciliar, neoplasias, fibrosis quística e inmunosupresión sistémica. El tejido quirúrgico se obtenía a nivel de la bula etmoidea anterior en los sujetos control y del propio pólipo en los pacientes con RSCcPN. Las células pNEC fueron aisladas por procedimientos estandarizados.
Cepas del S.aureus:
El S. aureus fue cultivado en agar luego centrifugado y el sobrenadante se filtro con acetato de celulosa para remover la bacteria, y filtrar los exoproductos del S. aureus que fueron calentados para inactivar la actividad de la proteasa.
ResponderEliminarEnsayos de reparación de heridas:
Las pNEC se sometían a injuria mecánica, se removían las células desprendidas y luego se trataban de forma aleatorizada en una de las siguientes condiciones: exposición al control negativo (0.5% LB), exposición a los exoproductos del S. aureus (al 0.25 y al 0.5%) y exposición a los exoproductos del S. aureus (al 0.25 y al 0.5%) y al inhibidor de ROCK. Como ensayo final se usaron los exoproductos inactivados por calor del S. aureus y las tasas de reparación del epitelio se reevaluaron bajo las siguientes condiciones: exposición al control negativo (0.5% LB), exposición a los exoproductos del S. aureus (0.5%) y exposición a los exoproductos inactivados por calor del S. aureus al 0.5%. marcas en los pozos permitieron que se tomaran imágenes de la herida en el mismo sitio a la hora 0 y a la hora 6, usando un microscopio.
Inmunofluorescencia:
Luego de la injuria (3 heridas mecánicas por portaobjetos), las monocapas de células se lavaron y luego fueron tratadas con cualquiera de las siguientes: control negativo (0.5% LB), exposición a los exoproductos del S. aureus al 0.5% y exposición a los exoproductos del S. aureus al 0.5% y al inhibidor de ROCK. En las imágenes por inmunofluorescencia, las células en el puente de la herida se clasificaron en las categorías “con” o “sin” lamelipodia y tambien como “morfología ambigua”.
Resultados:
En total 35 muestras de 19 pacientes con RSCcPN y 16 sujetos de control se incluyeron en el estudio. El epitelio es clave para inducir inflamación innata y adaptativa y es un proceso durante la RSCcPN, una perdida prolongada de la función de la barrera epitelial podría facilitar la entrada de patógenos que facilitan la inflamación crónica, por esto es importante evaluar si la habilidad de reparar el epitelio nasal difiere entre los pacientes con RSCcPN y los sujetos control. Para este propósito, las pNEC de los pacientes con RSCcPN y los sujetos control se cultivaron de forma paralela en las mismas condiciones y luego se les inducia injuria para comparar las tasas de curación. El análisis de la tasa de reparación de cada cultivo de pNEC de los sujetos control y de los pacientes con RSCcPN revelo variaciones entre los sujetos de cada grupo, sin embargo la tasa promedio de reparación de heridas fue significativamente más lenta (p menor de 0.01) en las monocapas pNEC de los pacientes con RSCcPN comparado con los pacientes control bajo las mismas mismas condiciones. Luego se evaluó si la exposición a los exoproductos del S. aureus podría alterar la capacidad de reparación del epitelio pNEC. Se observo una disminución significativa en la reparación de las monocapas pNEC control en la presencia de exoproductos del S. aureus al 0.25% (disminución del 34%). Un efecto inhibitorio fuerte (p menor de 0.001) se observo luego de la exposición a los exoproductos del S. aureus al 0.5%, con una disminución de la tasa de reparación del 69%).
Para determinar cual componente podría ser el responsable de esta respuesta deletérea, usaron exoproductos del S. aureus inactivados por calor al 0.5% y reevaluaron sus efectos en la reparación del epitelio de las monocapas pNEC de los pacientes con RSCcPN. Observaron que la reparación epitelial era débilmente influenciada por los exoproductos del S. aureus inactivados por calor al 0.5%.
La reparación epitelial es dependiente en varios mecanismos, uno de ellos coordinado y direccionado por la migración celular. Los filamentos de actina se organizan ellos mismos en una red dinámica y crean una protrusión membranosa en forma de sábana conocida como lamelipodia para optimizar este proceso. Evaluaron la formación de lamelipodia y su orientación usando un análisis kimográfico. Confirmaron que los LB por si mismos no tienen efecto en el movimiento celular. La exposición a los exoproductos del S.aureus indujo un 57% y 60% de disminución de la longitud y velocidad respectivamente, seguido de una recuperación parcial de estos parámetros al final de dos horas. En las células de los pacientes con RSCcPN, la longitud y la velocidad estaban alteradas en condiciones basales y con la exposición a los exoproductos del S. aureus empeoraron significativamente los niveles de protrusión de longitud y velocidad, y estos efectos fueron persistentes durante todo el periodo de exposición a los exoproductos del S.aureus. Bajo condiciones basales se observo que las células en la herida de las monocapas de pNEC de los sujetos control exhibían extensiones lamelipoidales mas pronunciadas que los cultivos de pNEC de las muestras de los pacientes con RSCcPN. El porcentaje de células con lamelipodia fue mucho menor en el epitelio de los pacientes con RSCcPN que en los sujetos control (41% vs 60%).
ResponderEliminarLas células pNEC de los sujetos control y de los pacientes con RSCcPN estaban alteradas luego de la exposición a los exoproductos del S.aureus, exhibiendo una forma más redondeada lo que sugiere una pérdida de la polarización celular y una reorganización del citoesqueleto de microtubulos
Dada la evidencia de que la familia Rho es importante en el proceso de curación de heridas en varios tipos celulares, se postula que el Y-27632, un potente inhibidor ROCK, podría restaurar la reparación epitelial a pesar de la presencia de los exoproductos del S. aureus. Inicialmente se realizo tratamiento con 5 micromoles/L del Y-27632, lo que en condiciones basales llevo a un incremento en la tasa de reparación epitelial del 23% mientras que concentraciones más altas alteraron la migración e indujeron apoptosis de las pNEC. Luego se expuso las monocapas de pNEC a los exoproductos del S. aureus en la presencia o ausencia del Y-27632 a 5 micromoles/L, el medicamento inhibió los efectos deletéreos del S. aureus, incremento la tasa de reparación 1.86 veces cuando se cultivo con S. aureus al 0.25% y 2.22 veces con el S.aureus al 0.5% comparado con la exposición al S.aureus en ausencia del Y-27632. El efecto de los exoproductos del S. aureus en la longitud y la velocidad tambien se redujo con del Y-27632. Se comparo la organización del citoesqueleto celular en la ausencia y presencia del Y-27632 luego de la exposición al S. aureus. Se confirmo que en ausencia del Y-27632, el S. aureus induce que las células adopte una forma redondeada con extensión lamelipoidal. El tratamiento con Y-27632 restauro parcialmente las extensiones lamelipoidales.
Discusión:
En este estudio se documento que hay un defecto intrínseco en la reparación epitelial en los pacientes con RSCcPN, además se demostró que la exposición a los exoproductos del S.aureus altera la reparación epitelial de las células normales y acentúa la reparación anormal en las células de los pacientes con RSCcPN. Se demostró que los efectos del S. aureus en la protrusión celular son más sostenidos en el tiempo en los cultivos de las pNEC de los pacientes con RSCcPN. Esto soporta que la recuperación de la disfunción de la barrera pudiera representar un mecanismo patogénico adicional por el que el S. aureus contribuye al desarrollo del RSCcPN.