Capítulo A4. Methods for IgE antibody testing: singleplex and multiplex assays. Jueves 24 de octubre
Capítulo A4. Methods for IgE antibody testing: singleplex and multiplex assays
Authors: Robert G. Hamilton, Jörg Kleine-Tebbe
Abstract
IgE antibody tests are run as singleplex (one), multi-allergen (<10) and multiplex (>100 allergen specificities) assays, all with particular design and performance features.
Allergen extracts remain the principal reagents for IgE assays; allergenic molecules supplement labile or missing allergens in extracts or are analyzed individually.
Allergenic molecules enhance the IgE assay’s analytical sensitivity, and improve its analytical specificity by separating serological cross-reactivity from primary (genuine) sensitization to an allergen source or by identifying risk-associated allergens.
The relevance of positive allergen-specific IgE antibody responses, either to extracts
or molecules, can only be determined by the physician based on the clinical context (history, challenge) and not by the test itself.
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ResponderEliminarINTRODUCCIÓN La medición serológica de los anticuerpos IgE proporciona al médico una medida del perfil de sensibilización alérgica del paciente. Se realizan dos tipos fundamentales de ensayos de anticuerpos IgE en el laboratorio de inmunología clínica. Los ensayos "Singleplex" o "monoplex" se refieren a métodos de laboratorio en los que se mide un analito por análisis. Los ensayos "multiplex" permiten detectar y cuantificar más de un analito en un único análisis de análisis. Este informe examina la tecnología, el rendimiento y la aplicación de ensayos de anticuerpos IgE multiplex y simple que utilizan extractos alergénicos y moléculas alergénicas (componentes) en el diagnóstico y posterior tratamiento de la enfermedad alérgica humana.
ResponderEliminarCONSIDERACIONES DE DISEÑO DE INMUNOQUÍMICA Se han utilizado dos químicas de ensayo fundamentales que se han denominado formatos de ensayo "clásicos" o "inversos" para detectar el anticuerpo IgE. Formato de ensayo de IgE "clásico": base de los ensayos multiplex y singleplex más actuales El ensayo no competitivo, heterogéneo (separación de libre y unido), inmunométrico (anticuerpo marcado) que emplea alergeno inmovilizado en un "alergosorbente" en fase sólida para unir anticuerpos específicos de todos Los isotipos del suero son el diseño que ha perdurado tanto en ensayos simples como múltiples que se utilizan en laboratorios clínicos.
Después de un lavado de tampón para separar el anticuerpo humano libre y unido, se agrega IgE antihumana marcada con radionúclidos, enzimas o fluorescencia para detectar anticuerpos IgE que se han unido al alergeno inmovilizado. La magnitud de la respuesta (recuentos por minuto: radioactividad, densidad óptica, quimioluminiscencia o fluorescencia) después del lavado final del tampón es proporcional a la cantidad de anticuerpo IgE específico de alergeno en el suero de prueba original. Formato de prueba de IgE inversa: base de ciertas pruebas de un solo complejo Un diseño de prueba de anti-IgE inversa o de captura utiliza un segundo paso de alergeno en fase líquida para detectar el anticuerpo IgE específico de alergeno. En este ensayo, toda la IgE (en teoría) se captura inicialmente del suero por una partícula paramagnética en fase sólida anti-IgE en exceso molar a la cantidad de IgE en la mayoría de los sueros de prueba. La IgE humana, el anticuerpo IgE específico de alergeno se detecta con cantidades limitadas de alergeno marcado. El formato de ensayo de fase inversa se ha utilizado para la cuantificación de anticuerpos IgE en el ADVIA Centaur.
La principal ventaja del ensayo de fase inversa sobre el clásico El ensayo singleplex basado en alergosorbentes es su tendencia a medir principalmente el anticuerpo IgE de alta afinidad que se supone que es "más" clínicamente relevante. Por el contrario, los ensayos que usan cantidades molares excesivas de alergeno que se han inmovilizado en un alergosorbente tienden a detecte más ampliamente tanto el anticuerpo IgE de baja afinidad como el de alta afinidad. El formato de ensayo inverso también aborda la preocupación de la inhibición competitiva causada por anticuerpos específicos de alérgenos de origen de isotipos no IgE tales como Ig G antialérgico que puede alcanzar niveles de microgramos por ml en suero de individuos que reciben inmunoterapia. Sin embargo, este formato de ensayo inverso es menos apto para su uso en ensayos multiplex donde los alérgenos marcados múltiples tendrían que agregarse al mismo recipiente de reacción. Sufre de un requerimiento de grandes cantidades de anticuerpo de captura anti-IgE para asegurar la unión de todas las moléculas de IgE del suero de prueba. El diseño del ensayo inverso también puede mostrar un sesgo importante porque su rendimiento depende de la fracción de IgE total que es específica para el alergeno de interés. Estas limitaciones en el diseño del ensayo han provocado la desaparición del formato de ensayo inverso del uso en laboratorios clínicos en los EE. UU Y en otros lugares.
ResponderEliminarCalibración heteróloga basada en IgE total para sistemas de IgE específicos de alérgenos de un solo complejo Se ha establecido el consenso de que un único sistema genérico de calibración de IgE total en suero es la única estrategia de calibración viable para usar en ensayos clínicos de anticuerpos IgE. Permite la interpolación de los resultados de anticuerpos IgE de cualquiera de los cientos de especificidades de alérgenos siempre que las porciones de IgE sérica total y de IgE específicas de alérgenos del ensayo se diluyan en paralelo entre sí. El sistema de calibración “heterólogo” de IgE sérica total que se usa en todos los ensayos singleplex regulados es rastreable hasta el 75/502 recientemente agotado de la Organización Mundial de la Salud y actualmente usa las terceras preparaciones de referencia de IgE humana 11/234. Este sistema de calibración permite la interpolación de resultados de anticuerpos IgE desde un límite de cuantificación de 0.1 kUA / L a niveles de 100 kUA / L de anticuerpos IgE. Aunque rara vez se realiza en pruebas clínicas, los niveles séricos de anticuerpos IgE superiores a 100 kUA / L se pueden determinar con precisión mediante un nuevo análisis del suero a una dilución y la posterior corrección matemática para el factor de dilución. La alternativa al esquema de interpolación heteróloga basada en IgE sérica total es el uso de calibraciones específicas de alérgenos individuales, una para cada especificidad de alérgenos. Los primeros intentos ya que el uso de este enfoque expuso su principal limitación, que implicaba una demanda de cantidades en litros de sueros IgE positivos para cada especificidad. Esto hizo que la estrategia de calibración de anticuerpos IgE específicos múltiples no sea práctica, especialmente porque no hay preparaciones de referencia de anticuerpos IgE policlonales humanos internacionalmente reconocidos. Ensayos multialérgenos versus multiplexes Un verdadero ensayo de anticuerpos multiplex permite que muchas especificidades de un solo isotipo de anticuerpo (por ejemplo, IgE) se detecten individualmente y se semicuantifiquen en un solo análisis
Este diseño de análisis se puede distinguir de un análisis de detección "multialérgico" en el que muchas especificidades de alérgenos de un grupo común (aeroalergenos o alérgenos alimentarios) se mezclan e inmovilizan como extractos o componentes en una sola fase sólida. Este reactivo multialergénico se usa típicamente en un formato de ensayo singleplex para detectar simultáneamente IgE específica a múltiples especificidades de anticuerpos en una sola reacción. Se genera un único resultado cualitativo (positivo o negativo) para cada muestra en función de un punto de corte positivo / negativo. Sin embargo, el médico solicitante no puede identificar definitivamente las especificidades de alérgenos reales que producen una respuesta positiva de anticuerpos IgE en el análisis de alergenos múltiples sin un análisis adicional utilizando análisis de ensayo de un solo complejo adicionales, uno para cada una de las especificidades de alérgenos individuales en el absorbente de múltiples alergenos. Un ensayo de detección de múltiples aeroalergenos ampliamente utilizado mide el anticuerpo IgE contra 10 o más aeroalergenos. Las especificidades de alérgenos inmovilizadas en una sola fase sólida se seleccionan cuidadosamente porque se sabe que son únicas o reaccionan de forma cruzada con las principales especificidades que inducen la mayoría de los síntomas alérgicos relacionados con el aeroalérgeno. Debido a su alto valor predictivo negativo, este ensayo multialerógeno en particular sirve como una pantalla rentable para descartar la sensibilización alérgica en un individuo con un historial cuestionable de alergia respiratoria y para definir el estado atópico de las personas que se inscriben en estudios de asma
ResponderEliminarHeterogeneidad en las mediciones de anticuerpos IgE de diferentes tipos de ensayos y fabricantes En la mayoría de los ensayos multiplex, las pequeñas cantidades de alérgenos individuales unidos a una fase sólida contrastan con la mayor capacidad de unión del anticuerpo IgE presente en polímeros hidrofílicos individuales y alergosorbentes basados en perlas que se usan clínicamente . Las restricciones de la Ley de Acción Masiva hacen que estos ensayos detecten diferentes distribuciones de anticuerpos IgE específicos de alérgenos en cualquier suero dado. La cantidad de anticuerpo detectado en el ensayo depende de múltiples factores, incluyendo la concentración del anticuerpo IgE, la afinidad, la especificidad del epítopo, la actividad específica de IgE (específica a la relación de IgE total) y el nivel de anticuerpos no IgE específicos para el alérgeno. Los alergosorbentes múltiplex más limitantes de antígenos tienden a unirse a más anticuerpos IgE específicos de alérgenos cuando es más alta en concentración, tiene una mayor afinidad, el suero tiene una mayor proporción de anticuerpos IgE específicos a IgE total y una menor concentración de alérgenos competitivos no específicos -IgE (típicamente IgG) de anticuerpos. Estas consideraciones de acción masiva tienen importantes consecuencias en el rendimiento del ensayo, especialmente cuando se analizan sueros con cantidades de nanogramos de anticuerpo IgE que están presentes con altos niveles de microgramos / ml de anticuerpo IgG específico para alérgenos. Tales niveles altos de antialérgicos IgG pueden resultar de la exposición natural involuntaria a altos niveles de alérgenos o hiperinmunización a través de la inmunoterapia con alérgenos. El anticuerpo IgG compite con los niveles más bajos de nanogramos / ml de anticuerpo IgE para sitios de unión a alérgenos limitados en el chip alergosorbente multiplex. Esta restricción ha sido citada como una ventaja del formato de ensayo multiplex en que su nivel más bajo de anticuerpo IgE específico de alergeno detectado en presencia de IgG alta de alergeno específico puede reflejar más de cerca la verdadera consecuencia biológica de la interferencia de IgG con la unión de alergeno a IgE unido a las células efectoras. Ventajas y limitaciones de los ensayos multiplex. Los ensayos multiplex son atractivos porque tienden a tener un tiempo de respuesta más corto para la generación de resultados. Tienden a usar menos volumen de muestra al probar simultáneamente múltiples especificidades de anticuerpos IgE en un área de superficie pequeña en la fase sólida. Su diseño de ensayo tiende a ser más simple, con menos reactivos y menos tiempo técnico que reduce los costos generales. Los ensayos multiplex, especialmente en un formato de casete portátil, son atractivos para su uso como pruebas de punto de atención. Estas ventajas se compensan con el límite de cuantificación potencialmente más bajo de los ensayos multiplex, la capacidad reducida de proporcionar niveles cuantitativos de anticuerpos para cada especificidad de IgE respectiva y un desafío mayor para optimizar el ensayo que implica el control de calidad simultáneo de muchos alérgenos inmovilizados. Existe el potencial de una mayor variabilidad entre lotes como resultado de la necesidad de equilibrar múltiples reactivos en diferentes puntos en un solo alergosorbente. Los menús de alérgenos fijos del ensayo multiplex fomentan la prueba de anticuerpos IgE para especificidades no deseadas o innecesarias. Finalmente, puede haber gastos adicionales asociados con la necesidad de comprar nuevos equipos para realizar un ensayo multiplex.
ResponderEliminarTECNOLOGÍA DE ENSAYO ACTUAL Sistemas de ensayo de IgE comunes basados en tecnología singleplex Muchas versiones del formato de ensayo de IgE "clásico" han sido aprobadas por los reguladores gubernamentales a lo largo de los años. En todo el mundo, tres autoanalizadores singleplex que utilizan el diseño "clásico" de alergosorbentes dominan el mercado actual de laboratorios clínicos. Estos son los ImmunoCAP (Thermofisher Scientific / Phadia); Immulite (Siemens Healthcare Diagnostics) y HyTEC88 (Hycor Biomedical). El último ensayo Hycor está siendo reemplazado por un nuevo autoanalizador llamado Falcon. En Europa, hay ensayos adicionales con la marca de la UE que utilizan un diseño de ensayo similar pero que no están disponibles en todo el mundo para su uso en laboratorios clínicos. Las características de rendimiento de los tres autoanalizadores predominantes de un solo complejo se han evaluado utilizando muestras de pacientes enmascaradas y datos de competencia entre laboratorios. Los tres autoanalizadores singleplex usan una curva de calibración de IgE total análoga. Muestran buena precisión, reproducibilidad e informan hasta el mismo límite de cuantificación de 0.1 kUA / L. Sin embargo, múltiples estudios han confirmado que informan diferentes niveles de anticuerpos IgE para cualquier especificidad dada, lo que indica que detectan diferentes distribuciones de anticuerpos IgE específicos para alérgenos. Esto probablemente se deba al uso de diferentes reactivos que contienen alérgenos y posiblemente a un resultado de procedimientos ligeramente diferentes para la calibración del ensayo y el cálculo de datos. Introducción de moléculas individuales (componentes) en ensayos simples y múltiples El avance científico más importante para impactar en el uso de ensayos múltiples en el laboratorio de diagnóstico de alergias ha sido la identificación desde el año 2000 y la purificación de componentes alergénicos de los principales aero, alimentos y venenos. alérgenos como se discute extensamente a lo largo de este libro. Se han empleado técnicas de biología molecular para generar formas recombinantes de muchos de los alérgenos y se aíslan otras de fuentes nativas extraídas utilizando diversos procedimientos de purificación. Las bibliotecas de alérgenos se han creado como lo ilustra la biblioteca de alérgenos alimentarios del proyecto EuroPrevall que ha establecido requisitos rigurosos de verificación y pureza para las moléculas alergénicas. Se han producido componentes alergénicos bien caracterizados de la leche de vaca y cabra, huevo de gallina, pescado, camarones, avellana, maní, apio y frutas de la familia de las rosáceas (manzana y durazno). La documentación de estos componentes alergénicos ha involucrado extensos análisis estructurales analíticos, inmunoquímicos y tridimensionales. La disponibilidad de cantidades ilimitadas de los alérgenos moleculares ha permitido utilizar métodos de análisis basados en microarrays de chip múltiple para la evaluación rápida y simultánea de sueros humanos para anticuerpos IgE contra múltiples especificidades de alérgenos. La ilustración más importante de la transición de la tecnología de los ensayos singleplex a multiplex ha involucrado el análisis de anticuerpos IgE multiplex
ResponderEliminarbasado en chip inicialmente informado por Hiller et al. (dieciséis). El microarray original basado en chips utilizó 94 moléculas de alérgenos purificadas, que se inmovilizaron covalentemente en arreglos de micro puntos fijos en un portaobjetos de vidrio preactivado. Los perfiles de anticuerpos IgE de individuos alérgicos se evaluaron frente a alérgenos causantes de enfermedades en un único análisis múltiple utilizando 40 microlitros de suero sin diluir. Con este informe, la aplicación clínica seria de los componentes alergénicos y los métodos de análisis multiplex están disponibles para evaluar a los individuos para detectar enfermedades alérgicas. A partir de esta prueba de concepto inicial, el repertorio de alérgenos ha aumentado y el límite inferior de cuantificación y reproducibilidad de los ensayos ha seguido mejorando. La versión comercial de este ensayo es el chip de alergeno de fase sólida inmune o ISAC.
ResponderEliminar(Thermofisher Scientific / Phadia) que requiere 40 microlitros de suero para detectar el anticuerpo IgE contra 112 moléculas alergénicas individuales que se encuentran en una matriz estática o plana en un portaobjetos de vidrio. El ISAC informa los niveles de anticuerpos IgE en unidades ISU, que se consideran semicuantitativos. Existe una buena correlación entre los niveles de componentes de leche de vaca anti-IgE sumados (Bos d 4, 5, 6, 8 y lactoferrina, r2 = 0,66), medidos en 44 sueros de individuos clínicamente alérgicos a la leche mediante el ImpleoCAP singleplex (eje x) y ISAC multiplex (eje y)
La correlación sigue siendo impresionante cuando uno compara los componentes individuales de la leche de vaca anti IgE (Bos d 4, 5, 6, 8 y lactoferrina, r2 = 0.77) medidos en el mismo suero por ImmunoCAP e ISAC. Sin embargo, la menor sensibilidad analítica del ISAC depende del alérgeno en cuestión y es evidente con muchos niveles de anticuerpos IgE fuertemente positivos detectados en el ImmunoCAP que son indetectables en los mismos sueros cuando se analizan en el ISAC.
Ensayos de IgE multiplex adicionales utilizados en investigación o en desarrollo Si bien el ISAC ha sido diseñado y evaluado exhaustivamente para su uso con moléculas alergénicas recombinantes y nativas purificadas, otros ensayos han empleado extractos de alérgenos inmovilizados en microarrays de chips y modificaciones de ensayos multiplex. A. Se ha producido una versión de investigación del ISAC llamada "Mecanismos para el desarrollo de ALLergy" o chip de alérgenos MeDALL con 170 moléculas de alérgenos para estudiar más ampliamente el desarrollo de anticuerpos IgE e IgG en niños Usando concentraciones definidas de IgE quimérica y Anticuerpos IgG específicos para Bet v 1, el estudio demostró que la presencia simultánea de anticuerpos bloqueadores de IgG puede inhibir efectivamente la unión del anticuerpo IgE al alergeno Bet v 1 que se ha inmovilizado en el chip multiplex. Por el contrario, los mismos niveles de IgG anti-Bet v1 producen una interferencia competitiva mínima en el ImmunoCAP singleplex más cargado de antígeno. Los autores sugieren que la inhibición de la unión de IgE por anticuerpos IgG de la misma especificidad a alergenos limitados inmovilizados en el chip puede reflejar más estrechamente las respuestas biológicas en condiciones de exposición natural a alérgenos. Sin embargo, la relevancia clínica de esta inhibición necesita más investigación. La menor cantidad de alérgeno en el chip también reduce el rango de trabajo del análisis de anticuerpos IgE en comparación con el ImmunoCAP de un solo complejo, cuyo alergosorbente tiene 10,000,000 veces más de alérgenos acoplados. B. En 2015, Williams et al. Reportaron pruebas comparativas con ISAC, ImmunoCAP y pruebas de punción en la piel de un autoanalizador multiplex basado en chips llamado MicrotestDx En contraste con el ISAC, utiliza 100 microlitros de suero y emplea 19 extractos de alérgenos y 16 moléculas alergénicas que cubren un total de 26 especificidades de alérgenos aero- y alimentarios que se inmovilizan covalentemente en un chip prerecubierto por triplicado. Esta es una versión reducida de un ensayo de prueba de concepto que utilizó 95 extractos de alérgenos y 8 proteínas recombinantes que se inmovilizaron en portaobjetos de microscopio de vidrio activados con aldehído. Estos datos comparativos iniciales de anticuerpos IgE son alentadores ya que la concordancia cualitativa positiva / negativa entre los métodos varió del 81% al 87% y la concordancia semicuantitativa (negativa, baja, moderada y alta) entre los 4 métodos varió del 60% al 77%
ResponderEliminarC. Wiltshire y col. detectó una pequeña cantidad de extractos de alérgenos en portaobjetos de microarrays activados y usó una interesante estrategia de amplificación de círculo de ADN rodante para detectar el anticuerpo IgE unido al alergeno inmovilizado. Feyzkhanova y col. Copolimerización fotoinducida de 21 alérgenos [15 extractos y 6 alérgenos moleculares] en un chip cubierto de hidrogel y usó 60 microlitros de suero para realizar análisis de microarrays de anticuerpos IgE. Renault y col. informaron un ensayo de microarrays en el que 350 alimentos desgrasados y extraídos se imprimieron en portaobjetos (4800 puntos por portaobjetos) y se detectaron simultáneamente anticuerpos humanos IgG, IgA, IgM e IgE en suero usando un escáner de 4 láser. Joshi y col. informaron sobre un microarray de imágenes de resonancia de plasmón de superficie de péptido de carbohidrato ultrasensible en el que inmovilizaron péptido y xilosil glucósido de Ara h 2 en portaobjetos de oro carboxilado y amplificaron la respuesta con perlas magnéticas de 1 micrón de diámetro recubiertas con ~ 60,000 moléculas policlonales anti-IgE . Estos microarrays de prueba de concepto que han utilizado nuevos sistemas de imágenes y extractos de alérgenos unidos a chips suscitan preocupaciones teóricas sobre la sensibilidad analítica de los ensayos y si la capacidad de unión limitada de la superficie del microdot en un chip de vidrio activado puede inmovilizar suficientes concentraciones molares de alérgeno (especialmente de extractos de alérgenos) para unir cuantitativamente el anticuerpo IgE en presencia de otros isotipos de anticuerpos.
ResponderEliminarD. Las tecnologías multiplex alternativas son capaces de detectar anticuerpos IgE en suero humano. El ensayo de matriz de suspensión basada en microesferas Luminex utiliza microesferas fluorescentes acopladas con alérgenos, una especificidad por tipo de microesferas. Cada tipo de perla emite una fluorescencia interna diferente que les permite distinguirse entre sí en un citómetro de flujo cuando se mezclan. Cada pocillo de una placa de microtitulación se carga con una mezcla de tipos de perlas (50 microlitros; 2000 perlas) y suero (50 microlitros a 1: 4). Después de una incubación y lavado, el anticuerpo IgE unido se detecta con anti-IgE biotinilada y avidinficoeritrina. La intensidad de fluorescencia en la superficie de los tipos de cuentas individuales se cuantifica e interpola a partir de una curva de calibración (intensidad fluorescente frente a IgE sérica total). En un estudio de prueba de concepto, este ensayo pudo medir el anticuerpo IgE específico para 6 componentes aeroalergénicos de los ácaros del polvo (Der p 1, Der p 2), caspa de gato (Fel d 1), caspa de perro (Can f 1), abedul polen de árboles (Bet v 1) y polen de hierba Timothy (Phl p 5). E. Meso-Scale Discovery ha empleado un enfoque de matriz múltiple diferente. En un análisis de prueba de concepto no publicado, las proteínas α-lactalbúmina, β-lactoglobulina A / B, α-β- ĸ-caseína, lactoferrina y BSA se biodotaron individualmente en puntos separados en placas NPT de 9 puntos. Cada punto dentro de la misma reacción permitió que se uniera una especificidad de anticuerpo separada. Después de la reacción con sueros alérgicos a la leche, se detectó el anticuerpo IgE unido con el anticuerpo anti-IgE humano marcado con Sulfo-Tag. El anticuerpo marcado unido cuando se expone a un pulso eléctrico genera quimioluminiscencia a través de una reacción de oxidación-reducción que se midió en un lector automático. Los niveles de respuesta se interpolaron desde una curva de calibración en unidades de anticuerpos IgE. En estudios piloto no publicados, se han demostrado correlaciones significativas entre el ensayo de la placa de puntos NPT9 y las estimaciones generadas por ImmunoCAP singleplex de los niveles de anticuerpos IgE. F. Un estudio de prueba de concepto investigó un ensayo de microarrays de alérgenos de flujo vertical con 10 moléculas alergénicas purificadas a 3 concentraciones que se inmovilizaron en membranas de nitrocelulosa de tamaño de poro de 0,1 um. Los anticuerpos IgE unidos de sueros humanos se detectaron con anti-IgE unida a nanopartículas de oro usando una lectura colorimétrica. Su precisión y relativa concordancia con ImpleoCAP singleplex fueron alentadoras. Sin embargo, para aplicar la estrategia de flujo vertical, se necesitan análisis de verificación adicionales para validar aún más la técnica utilizando estudios de comparación directa con muestras clínicas que se han analizado en paralelo con ensayos de IgE únicos y multiplex establecidos. G. Se ha desarrollado una nueva prueba de punto de cuidado biosensor de nanotecnología reportada por Abionic en la cual el suero se mezcla con anti-IgE marcado con fluorescencia y la mezcla se agrega a una cápsula que contiene 10 moléculas alergénicas acopladas a una superficie biosensora. La acción capilar impulsa la IgE específica de alergeno para unirse al alergeno inmovilizado y los complejos moleculares fluorescentes son medidos ópticamente por la unidad de lectura abioSCOPE. La respuesta fluorescente finalmente se traduce a una dosis de anticuerpo IgE. Esto se resume gráficamente por Chapman et al.
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